PCR检测支原体操作步骤由普拉特泽生物为大家总结分享，PCR检测是支原体检测中最常用的实验方法，其他分别是化学发光法、DNA染色法、支原体培养法等。普拉特泽生物表达检测平台长期为广大基础科研人员提供支原体检测外包服务，欢迎咨询。

       支原体因为个头小，能穿过0.22 μm滤器，并且在实验室内会潜在的扩散。支原体污染细胞后，培养液不一定会发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。所以支原体感染会使培养的细胞慢慢枯萎，使得用被污染的细胞样本做的实验完全失去
意义和价值。因此，有必要对新引进的细胞和实验过程中的细胞株进行支原体检测。

        PCR法检测的实验原理是：原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区如16S和23S间隔区，各种生物种间的碱基序列差别很大。这个间隔区的DNA 序列及长度在Mycoplasma 各个种间既有相对保守的部分，也有具有很大差异的部分。本制品是在编码16S 和23S rRNA的DNA 上设计一对F1/R1 引物，扩增编码16 S 和23S rRNA 的DNA 间隔区。此反应体系只特异性扩增 Mycoplasma DNA，检出灵敏度与特异性都很高。

        PCR法检测支原体操作步骤
 
  如下：

        1、支原体样品预处理

        收集200 ul样品于PCR管中，12000rpm离心5分钟，去除上清液，加入30 ul纯水或者PBS重悬，然后将其置于95℃加热10分钟，冷却到12℃，最后8000rpm离心2分钟，上清液为样品备用。

        2、支原引物检测

        3、PCR检测

        （1）将合成的引物稀释成终浓度为100 nmol/L的储藏液与10 nmol/L的工作液。

        （2）配制PCR预混液。

        （3）向以上反应混合液中加入检测样品（5ul以下），使总体积达到50ul。添加样本时应防止交叉污染。

        （4）把反应管放入PCR仪中，设定以下条件，进行PCR反应。PCR的检测下限是M. capricolum 1ng， M. hyopneumoniae和U. urealyticum 100pg、其他的Mycoplasma是10pg。但是Human DNA、Mouse DNA在100 ng时有非特异性片段扩增。

        （5）预先配置好1~1.5%的琼脂糖胶，将完成的PCR反应液依次加入到胶孔中并选择合适的Marker进行琼脂糖凝胶电泳。

        4、实验注意事项

        （1） PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。

        （2）检测前，待测细胞要用无双抗培养基培养7d。

        PCR法检测支原体因为操作简单、准确率高成为大家检测支原体最常用的方法，那PCR检测支原体的步骤和注意事项就给大家介绍到这里啦，如果您还有什么其他的技术问题或支原体检测外包的需求欢迎直接留言给客服，技术会第一时间回复您的哦~