免疫组化/IHC实验常见问题及其解决方法下篇由普拉特泽生物总结分享。普拉特泽生物病理实验平台在承接大量免疫组化代做实验后总结出了两篇我们最常遇到的问题和解决方法，上篇请戳《免疫组化/IHC实验常见问题及其解决方法上》，温故知新，随时复习。

        免疫组化常见问题一：杂信号一非特异性染色

        由于内源性lgG、Fc受体、过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素等存在的原因，同时组织在处理过程中如高温修复也会使更多的内源性生物素暴露，造成染色组织上会出现非抗原部位的非特异性染色、边缘效应等杂信号。原因分析如下

        1、全片着色

        （1）是否有效地去除了内源性酶和生物素。应注意的是并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。

        （2）封闭液的使用，是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色的消除方法是以二抗动物的非免疫血清(正常血清)，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。另外，取材时避开出血、坏死区也十分重要。目前市面上供应的些一抗稀释液，其分中含有大量的保护性蛋白，已经可以起到封闭液的作用，所以在使用这些稀释液稀释的一抗进行免疫组化操作时，一般可不必另外进行封闭操作。

        （3）所选择的抗体是否符合试验要求。因抗体不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定解等原因造成的非特异性染色可通过使用高纯度、高特异性的抗体来解决。

        （4）一抗的使用浓度是否过高。过高常常会出现整张片子着色。

        （5）冲洗是否充分，冲洗液体积及冲洗时间均需达到要求，应严格行程作规程

        （6）检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。

        （7）组织抗原弥散，染色结构不清，主要见于组织切片固定不及时或固定时间过短造成。如果抗原热修复的程度过于剧烈(过长时间)，有时也会出现抗原弥散的现象。

        （8）脱蜡不完全，粘片剂过多。

        2、免疫组化部分着色

        （1）局部着色：切片捞片时应一步到位，避免产生气泡，组织局部鼓起。

        （2）阴阳着色：切片未放平，滴加试剂偏向一侧。

        常见问题二：脱片

        1、多聚赖氨酸玻片质量的问题，购买切片时要注意品牌质量。

        2、组织切的不好，切片机的问题。例如，比较老旧的机器切的厚或者不均匀，或者实验操作人员手法不好等。

        3、没烤好，时间短，温度不够之类。

        4、操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

        5、修复的问题：抗原修复的高压时间过长，或者放进100度的修复液时手法不好，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。

        6、一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。

        7、样本组织的问题，组织有坏死之类越容易脱。

        好啦，那所有的免疫组化实验相关问题咱们就讲完啦，视频课程请戳《免疫组化/IHC 理论+实操》，科研本质是探索与推翻，或许我们的总结不够全面，补充和完善的任务就交给各位看文章的科研人，一起留言分享吧。