巨噬细胞分离与纯化实验步骤由普拉特泽生物跟大家一起学习。巨噬细胞是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，是生物体免疫系统中非常重要的一部分。巨噬细胞一直是生物医学科研人员的研究重点，普拉特泽生物流式检测平台为广大科研人员提供巨噬细胞实验外包服务，本文咱们先来看看巨噬细胞的分离与纯化步骤吧：

        一、细胞分离

        1、取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4%淀粉肉汤。3～4天以后收集腹腔细胞。

        2、如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从一步开始。放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部，沿腹中线注入3～4mL（豚鼠20～40ml，家兔50～70mL）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/mL肝素和10%小牛血清的PBS）。轻轻按摩腹部5分钟。

        3、以下均无菌操作。剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

        4、用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

        二、巨噬细胞的分离和纯化

        1、取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10 mL空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

        2、分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40 mL无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

        3、分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20 mL注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过00目的钢丝网，分离单细胞。

        4、以下过程均在4℃中进行。分别处移动图片理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心200×g10分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞，加入10 mL低渗液（20mmol/LTris，0.75%氯化铵，pH7.4），37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1%和10%。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。

        5、离心200×g10分钟，去上清液。用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液（比重1.077）上，离心400×g20分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。

        6、用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90%以上，巨噬细胞占全部细胞的90%以上。

        好啦，巨噬细胞的分离纯化实验咱们就讲解到这里啦，如果您还有什么其他的问题或有巨噬细胞外包的需求欢迎直接留言，普拉特泽生物随时为您服务~