【国自然热点文献分享】之表观遗传乙酰化-高分

上月的文献学习，我们梳理了一篇影响因子7分左右的关于乙酰化的SCI，文章涉及乙酰化研究的实验不多，是不是意犹未尽呢？今天，我们一起来看看影响因子16左右的文章怎么研究乙酰化的吧~

这次分享的文献题目是：KAT6A Acetylation of SMAD3 Regulates Myeloid-Derived Suppressor Cell Recruitment, Metastasis, and Immunotherapy in Triple-Negative Breast Cancer，影响因子为16.803分，两个月前才热乎乎的发表在Adv Sci杂志上。

想了解高分文章是怎么研究乙酰化的伙伴们，现在就跟着我，踏着之前文献解读的“标准步骤”往下看吧~

一、KAT6A的过表达与三阴性乳腺癌（TNBC）转移相关

为了确定KAT6A在乳腺癌转移中的作用，作者首先用METABRIC dataset 分析了16个赖氨酸乙酰转移酶（KAT）基因DNA拷贝数的改变情况。结果显示，KAT基因在TNBC中表现出不同程度的拷贝数扩增，而KAT6A拷贝数扩增最多（Figure 1A）。Kaplan-Meier分析发现KAT6A扩增拷贝数高的TNBC患者，总生存期更差（Figure 1B）。此外，高表达的KAT6A亦与无复发生存率的降低显著相关（Figure 1C）。

接下来的免疫组化结果显示远处转移的TNBC肿瘤KAT6A表达明显高于无肿瘤转移的TNBC（Figure 1C-1D）。与原发性TNBC肿瘤相比，KAT6A在淋巴结和肺转移中均显著上调（Figure 1F）。细胞水平检测发现，与MCF-10A细胞相比，KAT6A在所有检测的乳腺癌细胞中都有高表达，具有高转移能力的TNBC细胞中KAT6A蛋白水平高于非转移细胞（Figure 1G）。

在MDA-MB-231和BT-549细胞中敲低KAT6A（Figure 1H）显著降低了细胞的增殖能力（补充材料），侵袭和迁移能力（Figure 1I - 1J）以及原位异种移植瘤的生长和转移能力（Figure 1K-1L）。同时，KAT6A的敲低亦可显著抑制转移性肺结节的形成（Figure 1M- 1N）、延长动物的生存期（Figure 1O）。

这些数据表明，KAT6A对TNBC转移至关重要，KAT6A高表达的患者预后较差。

二、KAT6A使SMAD3在Lys20和Lys117发生乙酰化

为了探索KAT6A在乳腺癌转移中调控的下游靶点，作者从MDA-MB-231细胞中纯化了flag标记的KAT6A复合物，并进行MS分析。在鉴定出KAT6A可结合蛋白中，SMAD3高度富集（Figure 2A）。

外源性以及内源性Co-IP分析均证实KAT6A与SMAD3的存在相互作用（Figure 2B-2C）。GST pulldown实验发现纯化的重组KAT6A可直接与SMAD3相互作用，TGF-β1的刺激显著增强KAT6A-SMAD3的关联（Figure 2D）。在HEK293T细胞中，KAT6A与野生型SMAD3或缺失突变体SMAD3共表达分析发现：SMAD3的c端MH2结构域（氨基酸232-425）是与KAT6A关联所必需的（Figure 2E-2F）。

接下来，作者评估了KAT6A 敲低对SMAD3乙酰化的影响。TGF-β1激活SMAD3的乙酰化（Figure 2G），而KAT6A的敲低减弱了TGF-β1诱导的SMAD3乙酰化（Figure 2H）。与野生型 KAT6A相比，KAT6A乙酰转移酶活性缺陷突变体G657E或C543G/G657E显著减弱了SMAD3的乙酰化（Figure 2I）。

质谱分析发现SMAD3 MH1区域赖氨酸20（K20）和赖氨酸117（K117）发生乙酰化，同时，这两个残基在不同物种间高度保守（Figure 2J）。在TGF-β1刺激下，赖氨酸到精氨酸的突变降低KAT6A诱导的SMAD3乙酰化，而赖氨酸和精氨酸的同时突变消除SMAD3的乙酰化（Figure 2K）。使用纯化的重组活性KAT6A和重组WT SMAD3或K20R或K117R突变体进行体外KAT实验证实KAT6A对K20和K117的乙酰化（Figure 2L）。此外，与WT SMAD3相比，乙酰化模拟K20/117Q突变体增强了SMAD3与KAT6A的关联，而非乙酰化K20/117R突变体抑制了它们的相互作用（Figure 2M）。

因此，这些数据表明，KAT6A可以直接乙酰化SMAD3的K20和K117残基。

三、SMAD3的K20/K117乙酰化上调免疫反应相关细胞因子

鉴于SMAD3是一个关键转录因子，作者假设SMAD3的K20/K117乙酰化增强了其转录活性。为验证这一假设，在MDA-MB-231/sgSMAD3细胞中进行了RNA-Seq，这些细胞过表达Flag-SMAD3 WT或精氨酸赖氨酸共同突变体（2KQ突变体）。测序分析出554个在2KQ突变体组高表达的基因（Figure 3A）。这554个基因在与炎症和免疫反应相关信号通路中高度富集（Figure 3B）。接下来，结合TCGA数据库，作者筛选出无转移和复发的TNBC患者样本中高表达的14个基因（Figure 3C）。基因集富集分析显示，KAT6A乙酰化的SMAD3（SMAD3-2KQ）上调炎症和免疫反应相关的（IL-6、IL-22和TNFα）信号通路（Figure 3D）。

此外，QPCR分析发现，2KQ突变体促进了MDA-MB-231/sgSMAD3和BT-549/sgSMAD3细胞中IL-6、IL-22和TNFα的表达和分泌（Figure 3E-3F）。补充材料中，与SMAD3-WT相比，SMAD3-2KQ突变体显著提高了IL-6、IL-22和TNFA启动子的活性。ChIP-qPCR分析发现MDA-MB和BT-249细胞中SMAD3可与IL-6、IL-22和TNFA启动子结合。TGF-β1刺激确实可以以KAT6A依赖的方式导致这些细胞因子表达的增加。

综上，SMAD3的K20/K117乙酰化上调免疫应答相关细胞因子的表达。

四、SMAD3K的20/117位点乙酰化后能增加与KAT6A介导的TRIM24阅读蛋白的H3K23乙酰化，从而增强SMAD3的活性

文献表明，TRIM24是TRIM超家族中TRIM33相关的辅助因子，也是KAT6A介导的H3K23ac在癌症中的阅读蛋白。因此作者研究了K20/117乙酰化是否能影响SMAD3与TRIM33和/或TRIM24的结合作用。结果发现，在TGF-β1刺激的MDA-MB-231和BT-549细胞中，TRIM24和TRIM33均与SMAD3结合（Figure 4A-B），且过表达TRIM24后，其与SMAD3的结合增强了，而TRIM33与SMAD3的结合却遭到了破坏（Figure 4A）。另外发现，除了SMAD3之外，SMAD2和SMAD4与TRIM24没有特异性关联（Figure 4C）。此外，通过补充材料说明TRIM24蛋白的中间段的393-823氨基酸残基介导了与SMAD3的结合。过表达TRIM33后发现SMAD3-TRIM24的相互结合作用减少。以上结果说明TRIM24和TRIM33竞争性与TGF-β1激活的SMAD3蛋白相结合。

接下来，作者探索K20/117乙酰化对SMAD3与TRIM24和TRIM33结合的影响。与野生型SMAD3相比，乙酰化拟合2KQ突变体增强了TRIM24-SMAD3的相互作用，抑制了TRIM33与SMAD3的结合。而乙酰化缺失的2KQ突变体则得到了相反的结果（Figure 4D-4E）。2KQ突变体异位表达增加了IL-6、IL-22和TGF-β1的蛋白表达（Figure 4E）。以上结果表明，SMAD3的乙酰化促进了其与致癌基因TRIM24的相互作用，并降低了其与TRIM33肿瘤抑制因子的结合，从而增强了SMAD3的致癌活性。

作者通过文献得到假设：KAT6A乙酰化H3K23招募TRIM24-SMAD3复合物，增强SMAD3-染色质相互作用，进而导致乳腺癌中SMAD3活化增强。首先，作者采用TRIM24 F979A/N980A的突变体破坏了TRIM24-H3K23ac的交互作用，但对TRIM24与SMAD3的相关性没有影响（Figure 4F）。在MDA-MB-231细胞中，共表达HA-tagged的SMAD3 WT、2KQ或2KR突变体与WT TRIM24 F979A/N980A突变体。结果得到，与WT TRIM24相比，F979A/N980A突变降低H3K23ac与TRIM24以及SMAD3 WT和突变体的关联（Figure 4G），也降低了SMAD3 WT和2KQ突变体与IL-6、IL-22和TNFα启动子的结合作用, 从而抑制IL-6、IL-22和TNF-β1的表达（Figure 4H-4I）。与SMAD3 WT与F979A/N980A突变共转染组相比，2KQ突变显著增加其与IL-6、IL-22和TNFA启动子的结合以及增强IL-6、IL-22和TNFA的表达（Figure 4H-I）。这些结果表明SMAD3 2KQ突变增加IL-6、IL-22和TNFA的表达与H3K23ac没有相关性，但H3K23ac结合能进一步增加SMAD3 2KQ突变体的活性。

综上，KAT6A乙酰化SMAD3促进了SMAD3与H3K23ac阅读器TRIM24的结合，KAT6A介导的H3K23ac进一步增加了TRIM24/SMAD3-染色质关联，从而导致SMAD3信号激活增强。

五、SMAD3的K20/K117乙酰化通过增强CSC和MDSCs招募促进TNBC的转移

以上结果提示，KAT6A/SMAD3轴可能影响TNBC中的乳腺癌干细胞样细胞（BCSC）特性。dox诱导KAT6A的敲降降低了IL-6、IL-22和TNFα 的蛋白表达、p-STAT3、CSC相关蛋白SOX2和CD44的表达、ALDH +亚种群、细胞成球能力（Figure 5A-5D）。以上实验结果能被拟乙酰化SMAD3的异位表达的2KQ突变体所逆转（Figure 5A-5D）。此外，与对照组相比，KAT6A KD增加了E-cadherin的表达，降低了N-cadherin、ZEB1、Slug和Snail的表达，但在拟乙酰化SMAD3的异位表达的2KQ突变体组中未观察到此变化趋势（补充材料）。综上，KAT6A-SMAD3轴能促进TNBC中的BCSC特性。

为了研究KAT6A依赖SMAD3乙酰化对TNBC转移的调控作用，作者在有或没有KAT6A KD的4T1/sgSmad3细胞中表达Flag-SMAD3 WT和2KR突变体，从IL-6，IL-22，TNFα的表达、细胞增殖、迁移、侵袭、MDSCs招募、肺的微小转移等方面说明（补充材料）KAT6A诱导的SMAD3乙酰化能促进TNBC的转移。

接下来，作者利用4T1小鼠乳腺癌转移模型，研究SMAD3乙酰化对体内MDSCs招募的影响。与未诱导细胞相比，dox诱导的KAT6A KD降低了IL-6、IL-22和TNFα、p-STAT3的表达（Figure 5E），KAT6A KD抑制肿瘤生长、肺转移，延长小鼠存活期（Figure 5F-5J），抑制MDSCs向转移性肺组织和原位瘤的募集以及转移性肺组织CD4+/CD8+ T细胞耗竭（Figure 5F-5M+补充材料）。以上结果均能被乙酰化模拟SMAD3 2KQ突变体所逆转（Figure 5E-5M）。故，KAT6A依赖SMAD3乙酰化通过MDSCs招募促进TNBC转移。

为了进一步证明乳腺癌细胞分泌的促炎因子在SMAD3介导的肿瘤转移中的关键作用，作者构建了IL-6 KO 4T1细胞并发现IL-6 KO抑制了SMAD3-2KQ诱导的MDSCs募集（补充材料）。并在体内SMAD3-2KQ-诱导的MDSCs招募实验中也得到了证实（补充实验）。以上结果说明促炎因子IL-6亦参与SMAD3介导的肿瘤转移中过程。

综上，KAT6A诱导的SMAD3乙酰化不仅增强乳腺癌干细胞样细胞特性，同时通过持续产生免疫应答相关细胞因子诱导MDSCs招募，促进乳腺癌的进展。

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