非编码RNA的过表达和干扰

——搞定ncRNA，这些技术问题你需要额外注意！

文章开始前，先来2碗毒鸡汤提神醒脑：

第一碗：80%的lncRNA都表达在细胞核，做不了分子海绵去spong miRNA！

第二碗：绝大部分的circRNA都不能广泛结合到miRNA！

Hhhhhhhh，做分子海绵的宝宝们484好绝望嘞？但是该继续下去的课题含着泪跪着也要继续下去，下面开始正经话题！

三大非编码RNA（ncRNA），miRNA/lncRNA/circRNA仍然是医学基础研究领域最为火热的研究热点，大部分的研究人员在立项之初，通过查阅文献或二代测序+生物信息学分析，获得了合适的研究对象，但在实验推进的过程中却遇到了重重困难。

主要有以下几个原因：

1. 找错了转录本；

2. ncRNA的过表达和干扰，尤其是干扰很难成功实现；（本篇重点）

3. 靶向关系检测，及内源竞争性RNA的双荧光素酶检测很难获得阳性的互补配对结果；

4. ncRNA对裸鼠皮下荷瘤的影响常常无效。（本篇不讲）

针对这些常见问题，该如何去避免？

“如何核对转录本”

1. 每个特异的序列都有一个对应的编号（NCBI或者Ensembl），建议将对应的编号序列从网上下载下来后与提供的序列进行比对，确保一致性。

2. 必要时可通过Northern blot及RACE实验获得lncRNA各转录本序列全长。

“Non coding RNA 的干扰”

1.miRNA的过表达或干扰

通常使用模拟物（mimics）或拮抗剂（inhibitor）即可实现。如需进行动物实验，需要构建并包装腺（相关）病毒。然而腺病毒进入细胞往往引起细胞内干扰素反应，一般情况下不适合做RNAi实验，对miRNA的干扰虽然有相关报道，但不成熟。（意思就是不要想着包装miRNA干扰慢/腺病毒了，效果不好的）。

下面整理了一份慢病毒/腺病毒表达系统的特征，各位看官根据实际需求进行病毒类型的选择：

2. LncRNA的干扰

为什么lncRNA的干扰总是失败，首先我们明确RNAi技术是发生在转录后的细胞质中的。而lncRNA的转录发生在细胞核内，有的最终表达于细胞质，有的表达于细胞核，有的lncRNA则细胞核和细胞质中均有表达，故而针对lncRNA的干扰是否能成功，首先最需要的明确是这个lncRNA的表达定位。核内表达的lncRNA是不能通过shRNA被成功干扰的。那么有几项工作需要在干扰前做好：

1. 查找相关数据库，或者该lncRNA的表达定位；

2. 细胞核/质分离后，QPCR检测lncRNA表达，或FISH（荧光原位杂交）以明确lncRNA的亚细胞定位，而这点常常被刚涉猎lncRNA研究的人们忽略。

如果lncRNA在目的细胞中是表达于细胞质，则可使用shRNA进行干扰。另外，对于LncRNA的基因表达水平的调控可以考虑使用CRISPR/Cas9系统。但由于LncRNA是不翻译蛋白的RNA序列，一般通过与相关元件蛋白接合而调控基因表达。

在不确定具体的调控位点的情况下，一般的单靶点切割并不一定会导致基因表达水平的降低（在靶向非调控区域的情况下），此时可尝试使用双sgRNA系统。通过同时在两个位点的切割，造成整段或者一段基因组序列的缺失，进而导致转录水平的降低（极致情况下几乎完全不转录）。

3.circRNA的过表达及干扰

circRNA本身环形结构的特殊性在表达载体构建过程中，一旦设计或操作不当很容易出现或缺失插入碱基的情况

目前国内有公司对circRNA的表达载体进行了改造，加入环化表达框架，使环状RNA连入载体后能在体外高效率表达，并保证插入的目的环状RNA片段正确环化。因此如要进行circRNA的过表达，选择合适的表达载体非常重要（这个载体还是很贵的，大概七八千吧），另外还需要确保转染后QPCR引物的设计能够有效扩增出环状的RNA，而非线性化的RNA。

circRNA由于它特殊的环状结构，及与线性化宿主基因的同源性，导致经常被无效或错误干扰。

首先明确circRNA的siRNA设计原则：

（1）针对外显子环化circRNA本身做敲除，设计backsplice junction位点前后序列并设计siRNA（靶点必须跨backsplice junction位点）；

（2）内含子环化circRNA，设计backsplice junction位点前后序列并设计siRNA，或针对内含子区进行siRNA设计（靶点不一定跨backsplice junction位点，但是最好跨）；

（3）每个siRNA需要设置对照，backsplice junction位点一段互补配对，另一段错配。

同时circRNA的QPCR引物设计也需要进行跨环设计，以避免非特异性扩增到线性宿主RNA。

再说一个旁门左道，如果是外显子成环的circRNA干扰，可以考虑成环因素（一般是在内含子中），特异性地靶向导致成环的内含子，使其成环受阻，也可以特异性地做到cirRNA的敲除。

另外非常重要的一点，也是常被研究者们忽略的一点，即对circRNA设计siRNA主要考虑的因素还有避免干扰到线性宿主基因（因为外显子环化而来的circRNA和线性宿主基因的RNA序列很可能是一毛一样的，而大部分的circRNA又都是外显子环化而来的。）如由于线性化的宿主基因被错误干扰后导致了细胞功能的改变，无法说明是circRNA的功能，即便设计的siRNA靶位点是针对circRNA的。在下游的检测实验中，也需要对线性化的mRNA进行消化，以保留环状RNA。如何避免设计的siRNA与线性转录本发生结合，遵循这三条原则（下面这段是小编抄的）：

（1）Binding site at the head-to-tail junction；（siRNA需绑定到circRNA环的首尾链接处）

（2）7-mer seed not present in the linear host gene;（至少有7个碱基没有在线性宿主基因出现）

（3） chemical modifications within the seed region.（在靶点区域有化学修饰，以避免似于miRNA效应的影响）

所以综上，小编总结了以下几点：

1. 做miRNA的过表达和干扰，主要还是mimics/pre-miRNA或inhibitor，上到动物可以用腺病毒过表达，干扰不建议包病毒。

2. 做lncRNA的过表达，有钱且省事的方式可以直接全序列直接合成，省钱但不是很省事的方法是做模板调取，比较烦躁的是万一调出来有突变还得花时间修复。lncRNA的干扰手段主要是shRNA或sgRNA，推荐双sgRNA。

3. 做circRNA的干扰主要还是考虑shRNA或sgRNA，但需要特别注意靶点设计和下游QPCR引物设计的注意事项，避免错误干扰或检测。circRNA的过表达最好买专门的表达载体以成环，一般的表达载体只能转录出线性化的RNA，和环状的circRNA虽然序列相同但结构不同，很难模拟circRNA本身的生物学功能。

“技术干货，确实难读~为了项目，慢慢嚼吧。”