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EdU检测实验操作步骤——及荧光定量分析数据

2023-08-09 10:04:48

来源/作者:普拉特泽-生物医学整体课题外包平台

一、实验目的

EdU检测不同转染处理对细胞增殖能力的影响。


二、实验样品

2.1 实验样本

备注:包括干预细胞用的相关试剂均按实验样品登记,每行登记一个或一组独立样品。

2.2 实验参数


三、实验结果

                     图1:EdU荧光检测示例图



                                              图2:荧光定量分析柱状图



四、实验结论

  如图所示,在CAL27细胞中,mimics NC和miR-23b-3p mimics组间无明显差异,与inhibitorNC组相比,miR-23b-3p inhibitor组细胞增殖能力有所上调;SCC25细胞各组间无明显差异。


请注意:因无法获知研究背景及研究方案,我司提交的结果说明仅针对该次检测结果进行客观描述,所下结论仅供参考。请合理判断该检测结果的可用性。


五、实验步骤

3.1 细胞复苏 (如有)

(1)将ddH2O预温至37℃。

(2)戴上手套和口罩帽子,从液氮罐中取出装有目的细胞的冻存管(内有1 mL细胞混合液),立即投入37℃ ddH2O中,轻摇冻存管使之在1分钟内快速溶解。

(3)完全溶解后,75%酒精擦拭冻存管外壁消毒后带进超净台。

(4)在超净台中,在15 mL灭菌离心管中预先加入10 mL新鲜配制的培养基,打开冻存管,将所有冻融的细胞悬液加入该离心管中,常温1000 rpm离心3分钟,吸除上层的培养液。

(5)1 mL培养基重悬细胞沉淀,轻轻吹打混匀后加入T25细胞培养瓶中,补足培养基至5 mL,置于37℃、5% CO2培养箱培养。

(6)48小时后换液,细胞融合接近80%时即可传代。

3.2 细胞铺板及转染 (如有)

取处于对数生长期,生长状态良好的293T细胞用0.25%胰酶消化后,通过细胞计数计算后,按照密度为4×104个细胞/孔,种到24孔板中,铺细胞18-24 h (尽量不要超过24小时,否则影响转染效率),细胞长至70~90%转染(细胞密度过稀或者过密均会影响转染效率),以24孔板为例:

(1) 将 1.6 μL LipoFiter /2 μL Lipo2000加入50 μLopti-mem Medium中,变成预混液1,室温放置5 min。

(2) 将0.8 μg质粒/20 pmol目的片段加入到50 μL opti-mem Medium中混合,变成预混液2。

(3) 将质粒和 LipoFiter/Lipo2000混合(预混液1和预混液2进行混合),室温放置20分钟。

(4) 将24孔板里的完全培养基换成150 μL opti-mem Medium。

(5) 将转染混合液缓慢加入到24孔板,轻轻前后晃动混匀。

(6) 37℃,5% CO2培养6 h后将培养基换成完全培养基。

3.3 EdU检测实验步骤

EdU 标记:

(1)用细胞完全培养基按比例稀释EdU溶液,制备适量2×EdU 工作液,终浓度为50μM; 

(2)每孔加入37°水浴的 EdU 工作液液500μL和500μL培养基(1比1),混合均匀后于培养箱孵育6-7小时(可根据细胞增殖速度,适当调整孵育时间),使EdU终浓度为50 μM ; 

(3)弃孵育培养基,PBS(含3%BSA,以下PBS表示)清洗细胞3次,每次5分钟。 

细胞固定及通透:

(1)每孔加入1 mL细胞固定液 (即含4%多聚甲醛的 PBS)室温孵育15分钟,弃固定液;  

(2)每孔加入PBS,清洗3次,每次5分钟;

(3)每孔加入1 mL渗透剂(0.3% TritonX-100的PBS)室温孵育15分钟;PBS清洗3次,每次5分钟

EdU检测:

(1)每孔加入0.2 ml Click反应混合液,轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品,体系按需配置;避光反应1-2小时;

(2)吸除Click反应液,用洗涤液洗涤3次,每次3-5分钟;  

DNA 染色:

(1) DAPI溶液的配制:按1:1000比例用PBS稀释DAPI (1000X),避光保存; 

(2) 每孔加1X DAPI溶液1ml,室温避光孵育10分钟左右;

(3)每孔加入PBS 清洗 1~3 次;

(4)采图。

五、荧光定量分析数据



注:组化定量分析采用image pro plus 6.0软件,IOD值为图片上各点光密度值的累加,此值与目标物质的总量成正比;IOD值除以目标分布区域的面积,得到平均density,此值反映了目标物质的单位面积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时,就是比较他们之间的平均光密度值的大小。

单位为a.u.(arbitrary unit),是无量纲单位

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