【国自然热点文献分享】之表观遗传之泛素化-高分文章

还是按着我们一贯的套路来学习和分享这篇泛素化的高分文献~

这次分享的文献题目是：CHIP-mediated CIB1 ubiquitination regulated epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis in lung adenocarcinoma，影响因子为15.820分，发表在Cell Death & Differentiation杂志上，发表时间为2020年10月，该文章主要探究了CHIP介导CIB1泛素化过程，从而调控肺腺癌的上皮-间质转化和肿瘤的转移。接下来通过作者得到的实验结果来分析这篇文章吧!

一、CIB1在肺腺癌中是一个促癌因子，跟不良预后呈正相关

从作者团队前面的研究中得到36个有差异表达的膜蛋白结合数据库分析筛选出CIB1作为研究对象。从ONCOMING数据库分析得到，CIB1的表达显著增高（Fig 1A），免疫组化检测作者收集到的肺腺癌组织及相对应的正常组织中CIB1的蛋白水平，发现CIB1表达水平明显增高，而且显示表达主要在细胞质和细胞膜当中（Fig 1B），qPCR实验检测CIB1的mRNA水平，结果也与蛋白水平趋势一致（Fig 1C），而且，CIB1在肺腺癌细胞中的mRNA及蛋白表达水平也显著高于正常细胞（Fig 1D-E）。通过临床分析发现，高表达的CIB1的病人的淋巴结转移更加明显,以及影响肿瘤分期（Fig 1F-G），而且，CIB1在肿瘤组织中高表达的患者的总生存期和无病生存期均短于低表达的患者（Fig 1H-I）。

以上结果说明，CIB1在肺腺癌中高表达，并且与临床特征和预后差密切相关。

二、体外实验表明，CIB1可通过AKT途径促进肺腺癌细胞迁移、侵袭能力，诱导EMT发生

首先，作者选用了两株相对高表达CIB1（PC-9/H1437）以及两株相对低表达CIB1的肺腺癌细胞株（A549/H1299），用于后续实验。然后，在A549/H1299细胞株中过表达CIB1，结果发现，过表达CIB1之后，细胞的迁移和侵袭能力都大大增强了；相反，在PC-9/H1437细胞株中，敲低CIB1后，细胞的迁移和侵袭能力显著受到抑制（Fig 2A-E）。已经有文献表明， CIB1过表达可导致AKT的异常激活，从而促进肿瘤细胞的发育；而且AKT通路在多种致癌过程中发挥核心作用，如与EMT过程密切相关。因此，作者进一步检测了与AKT通路和EMT过程相关蛋白的表达情况。结果表明，在肺腺癌细胞中，CIB1可以促进肺腺癌中AKT的磷酸化来激活AKT通路（Fig 2F）。CIB1下调后，EMT标记物N-cadherin、Vimentin表达下调，E-cadherin则表达上调，说明敲低CIB1后，抑制了肺腺癌细胞的EMT过程，而过表达CIB1，则促进了其EMT过程（Fig 2F）,同时，加入AKT通路的抑制剂（MK-2206）之后，过表达CIB1的细胞中的N-cadherin、Vimentin表达受到抑制，而E-cadherin表达增多，说明阻断AKT通路后，EMT过程也被阻断，而在敲低CIB1细胞不受其影响（Fig 2F）。

以上结果说明，CIB1可通过AKT途径促进肺腺癌细胞迁移、侵袭能力，诱导EMT发生。

三、CHIP可与CIB1相互作用并通过泛素-蛋白酶体途径降低CIB1蛋白水平

为了鉴定与CIB1相互作用的蛋白，使用抗CIB1或IgG抗体进行免疫沉淀，然后使用LS-MS进行鉴定。相互作用的蛋白需满足：在两个LC-MS分析中，基于≥2个多肽以≥95%的置信度且平均比率变化≥1.5。根据上述条件，有38种蛋白被筛选出来（Fig 3A）。因为泛素-蛋白酶体系统与蛋白质的降解密切相关，因此选择CHIP（E3泛素连接酶）用于后续的研究。采用CHIP实验证实CHIP与CIB1之间能相互结合（Fig 3B）。免疫荧光检测发现CHIP与CIB1在细胞质和细胞核中均有共同表达（Fig 3H）。在PC-9和HEK293细胞中过表达CHIP观察到CIB1表达受到抑制(Fig 3C-D)；此外,在HEK293细胞中观察到CHIP能以剂量依赖的方式降低CIB1（Fig 3G）。免疫组化染色显示，60例患者中的CHIP在组织中低表达，与CIB1表达呈负相关（Fig 3E-F）。采用CHX测量CIB1的半衰期，发现CHIP降低了CIB1的稳定性（Fig 3I）。过表达Myc-CHIP可下调CIB1的蛋白水平，但MG-132(蛋白酶体抑制剂)干预后，CHIP下调CIB1的蛋白水平被逆转。但是，用leupeptin（蛋白酶抑制剂）干预并不能逆转（Fig 3J）。

以上结果说明， CHIP诱导的CIB1蛋白水平下降依赖于泛素-蛋白酶体途径。

四、CHIP通过泛素k48位点促进了CIB1的蛋白降解

前面作者已证实CHIP可能通过泛素化蛋白酶体途径促进CIB1降解。那么是哪个泛素因子在其中起作用呢。作者通过一系列的蛋白互作实验找到了关键因子。我们来一起看看吧。

首先，作者过表达CHIP后用CIB1抗体沉淀CIB1蛋白，并用泛素抗体检测，发现转染CHIP的细胞中CIB1泛素化水平明显高于转染空白质粒的细胞（Figure 4A）。此外，当将flag-CIB1、HA泛素和Myc-CHIP过表达质粒共转染到HEK293T细胞中时，flag-CIB1的泛素化水平显著升高（Figure 4B）。

接下来，作者构建了一个敲除CHIP的泛素连接酶结构域的CHIP-ΔUbox质粒。COIP实验发现，CHIP-ΔUbox突变体不能增加CIB1的泛素化水平（Figure 4C-D）。此外，体外重组CHIP和CIB1的泛素化分析显示，CHIP显著增强了CIB1的泛素化水平（Figure 4F）。

最后，分别将K48和K63转移到HEK293细胞中。K48泛素突变后，CHIP介导的CIB1泛素化消失，而K63突变没有变化（Figure 4E）。

综上，CHIP通过泛素的Lys-48残基促进CIB1泛素化，从而调节CIB1的蛋白表达。

五、CHIP靶向CIB1的第10位和第65位赖氨酸进行泛素化

接下来作者进一步探索CIB1上的哪个赖氨酸可能是导致泛素化修饰的位点。先将CIB1上的8个赖氨酸残基（K10, K24, K65, K70, K83, K107, K150, K188）突变为鸟氨酸，与带HA标签的泛素共转染HEK293T细胞。结果显示，K10和K65赖氨酸突变后，CIB1的泛素化水平显著降低（Figure 5A）。进一步研究发现，在K10和K65同时突变后，与单个突变相比，CIB1的泛素化水平显著减少（Figure 5B）。同时，当K10和K65共突变为鸟氨酸时，CHIP过表达引起Flag-CIB1下调（Figure 5C）。

综上结果提示K10和K65可能是CIB1的泛素化位点。

六、CIB1受CHIP的负调控，影响肺腺癌细胞的体外转移能力

前面的实验确认了CIB1和CHIP间的相互关系，接下来就看看CHIP对CIB1介导的肺腺癌迁移和侵袭的影响。Transwell和划痕实验发现，过表达CIB1提高了肺腺癌细胞的转移和侵袭能力，而CHIP的过表达可抑制由过表达CIB1诱导的转移和侵袭能力，但CHIP-ΔUbox没有产生相同的效果（Figure 6A-C）。

此外，WB结果显示CHIP/CIB1亦会影响P-AKT通路和上皮间质转化因子的表达。CHIP的过表达可降低由CIB1诱导的p-AKT的表达。同时，CIB1可上调N-Cadherin和Vimentin，下调E-cadherin的表达，而CHIP的过表达可逆转上述结果，但CHIP-ΔUbox不具有逆转功能（Figure 6D）。

上述结果说明，CIB1受CHIP负调控，影响肺腺癌细胞的转移能力。

七、CIB1受CHIP的负调控，并影响肺腺癌细胞的体内转移能力

前面作者发现CHIP可以缓解CIB1诱导的LAC增强的体外迁移能力和转移能力，接下来我们看看在体内是否可以观察到同样的结果。尾静脉注射细胞后，发现与NC组相比，A549CIB1组小鼠转移能力增强。此外，与A549CIB1/CHIP-ΔUbox相比，A549CIB1/CHIP组转移能力降低（Figure 7A -C）。上述结论在HE和IHC实验中亦得到了证实（Figure7D）。同时，在补充材料中，作者也发现下调CHIP表达能显著提高CIB1过表达诱导的转移能力。

综上，体内实验亦证实CIB1可以被CHIP负调控，影响肺腺癌细胞的转移能力。

结果到这里就已经全部分享完哒，相信各位阅读的朋友们已经对这篇文献的整体思路有了一个大概的了解。

我们在这里和大家一起再来捋一下整体的思路。

首先，作者通过他们前面的研究中筛选出CIB1这个蛋白作为研究目标，通过对临床组织进行一系列实验以及了解CIB1对肺腺癌的预后情况，再在细胞层面上过表达/敲除CIB1得到其对肺腺癌细胞功能学实验的影响。

其次，通过Co-IP和质谱筛选出与CIB1结合的蛋白CHIP，通过一系列实验证明了CHIP可以通过泛素-降解途径影响CIB1的表达，并得到泛素的K48以及CIB1的K10和K65位点参与CHIP对CIB1的表达。

最后，采用回复实验，在细胞层面和动物层面验证CHIP对CIB1的调控关系。

好的，本月的两篇与泛素化相关的文献都已分享完毕。