图1 Treg细胞流式检测设门策略

Treg细胞简介

调节性T细胞(Regulatory cells,简称Tregs )是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，早期亦称做suppressor T cells。调节性T细胞可分为天然产生的自然调节性T细胞（n T-regs）和诱导产生的适应性调节性T细胞(a T-regs或i T-regs)，如Th3、Tr1，另外尚有CD8 Treg、NKT细胞等，与自身免疫性疾病的发生关系密切，其异常表达可导致自身免疫性疾病。其中Tr1细胞分泌IL-10；Th3细胞分泌TGF-β；

1995年Sakaguchi发现成年鼠中近10%的外周CD4+T细胞表达IL-2受体α链CD25。去除这群细胞会引起小鼠自发产生多种自身免疫性疾病而回输该细胞则阻止疾病的发生。因此将这群细胞命名为CD4⁺CD25⁺调节性T细胞Treg。

调节性T细胞与自身免疫性疾病（如I型糖尿病、系统性红斑狼疮、再生障碍性贫血、多发性硬化、炎症性肠病、重症肌无力）有关联，类风湿性关节炎、自身免疫性甲状腺炎，自身免疫性肝病、多种肾脏疾病等很多自身免疫性疾病的发病也有关。调节性T细胞对于自身免疫性疾病的发生和发展都具有重要意义，对其进行深入研究将有助于了解自身免疫性疾病的发病机制，对疾病预后判断、进一步的治疗有着深远的意义。

Treg细胞流式染色实例

Human (Blood): Treg cells

1.标志物：CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ cells；

2.流式细胞仪：Beckman Coulter，CytoFLEX；

3.Panel设置如下

图一

备注：由于CD25属于连续性表达的抗体，尽量在允许的条件下设置FMO对照，FoxP3我们强烈建议使用FMO对照，因为表达量不高，如果不设置FMO，可能会设门不正确的情况。

4.流式抗体及用量：FITC anti-humanCD4(5μL/test；357406；Biolegend)， APC anti-human CD25 (5μL/test； 302610； Biolegend)， PE anti-human Foxp3(5μL/test；320208； Biolegend)；

5.淋巴细胞分离：采用人淋巴细胞分离液（7111011，达科为生物）分离人外周血淋巴细胞。首先取3 mL淋巴细胞分离液，平衡到室温，然后把用3mL PBS稀释3mL外周血后加到淋巴细胞分离液上层（注意小心操作，切勿把血液加到淋巴细胞分离液下层），500g离心30 min取白膜层细胞，2mL PBS洗涤2~3次后，细胞计数，调整细胞浓度至1×10⁷个/mL，后续实验全部采用100μL /tests/10⁶cells。

6.染色条件：首先Human TruStain FcX™(5μL/test;422302;Biolegend)，4℃，15 min； 接着CD4和CD25表面染色，4℃， 30 min；然后破膜固定（True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set；424401；Biolegend；一般情况下采用True-Nuclear™ Fix Diluent稀释True-Nuclear™ 4× Fix Concentrate为1×Fix solution)，室温避光，60 min后采用ddH₂O稀释10× PermBuffer成1×Perm Buffer进行破膜，重复2~3次；

最后采用100μL1×Perm Buffer重悬细胞，Foxp3核内染色，4℃，30 min。

7.     分析软件：Flowjo (10.0.7)；

8.     圈门策略及染色: 见图2

图2 不同供应商的Foxp3和破膜剂染色效果比对