原位杂交检测实验报告（五）由普拉特泽生物技术为大家总结分享。本文是关于原位杂交检测实验报告的最后一篇介绍，前面我们学习了原位杂交检测实验报告（一）、原位杂交检测实验报告（二）、荧光原位杂交检测实验报告（三）以及原位杂交检测实验报告（四），可以点击标题直接传送回去学习的哦。普拉特泽生物分子检测平台承接酵母双杂实验外包上百例，早就为大家把实验过程中要踩的雷、吃的亏帮大家吃完了，现在我们就来看看，原位杂交检测实验还有那些报告可参考：

前期回顾：

原位杂交检测实验报告（一）

原位杂交检测实验报告（二）

荧光原位杂交检测实验报告（三）

原位杂交检测实验报告（四）

一、实验目的

用FISH技术检测靶基因的定位情况。

二、实验原理

原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。基本原理--碱基互补配对原理。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。

三、实验结论

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，mRNA探针探针为红色。

四、实验材料

1.主要仪器

2.主要试剂

一、实验步骤

试剂准备:

1）lncRNAProbeMix储存液（20μM），恢复至室温。

2）U6，18S内参探针储存液（20μM），恢复至室温。

3）预杂交液：将适量BlockingSolution与Pre-hybridizationBuffer按照1：99混匀后，37℃孵育至透明澄清状态（约30min）后，分装保存。在使用前，须在37℃气浴或水浴中孵育至澄清透明。

4）杂交液：将适量BlockingSolution与HybridizationBuffer按照1：99混匀，37℃孵育30min后分装保存。在使用前，须先在37℃气浴或水浴中孵育30min。杂交液颜色偏黄属于正常现象。注：Pre-hybridizationBuffer（试剂A）和HybridizationBuffer（试剂B）从低温取出时可能有沉淀析出，属于正常现象。

5）将适量100XDAPI染色液（试剂D）与PBS按照1：99混匀，制备1XDAPI染色液。 

自备试剂：1）4%多聚甲醛2）通透液（含0.5%TritonX-100的PBS）3）1XPBS4）4XSSC5）杂交洗液I（4XSSC，0.1%Tween-20）6）杂交洗液II（2XSSC）7）杂交洗液III（1XSSC）8）封片剂。

FISH染色：

注：不同细胞系需根据其自身特性进行优化和调整实验条件（固定、通透、杂交和洗脱），如在预实验中发现杂交效果不好或者背景太高，请适当地调整反应时间与洗脱强度

1.细胞培养将细胞爬片置于24孔板孔底，培养适量细胞（～6X104/孔）。实验前使细胞融合度达到60%-70%。注：爬片与底板间不要产生气泡。

2.细胞固定与通透a.【1XPBS】清洗细胞5min；b.【4%多聚甲醛】室温固定10min；c.【1XPBS】清洗细胞5min，共3次；d.每孔加入1mL预冷的【通透液】，4°C静置5min；e.弃去【通透液】后，加入【1XPBS】清洗细胞5min，3次。

3.探针检测

a.每孔加入200uL【预杂交液】，37°C封闭30min；

b.预杂交同时，将【杂交液】在37°C中预热；

c.避光条件下，把2.5uL20uM【lncRNAFISHProbeMix储存液】或【内参FISHProbeMix储存液】加入到100μl【杂交液】中；注：探针浓度可根据具体实验情况进行优化。

d.弃去每孔细胞中的【预杂交液】，加入100uL含有探针的【探针杂交液】，避光，37°C杂交过夜；注：探针杂交液的用量具体依据细胞爬片待杂交区域优化，只需保证细胞能充分接触杂交液并且不出现干片的情况即可。

e.避光，42°C，【杂交洗液I】清洗每孔细胞3次，每次5min，以降低背景信号；

f.避光，42°C，【杂交洗液II】清洗细胞1次；g.避光，42°C，【杂交洗液III】清洗细胞1次；h.避光，【1XPBS】清洗细胞，室温5min。注：所有指定温度的步骤，注意将相关试剂预热到对应实验所需温度后再使用。

4. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，生理盐水4次洗去多余的DAPI；

在荧光显微镜下观察采集图像。

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