Western blot（蛋白质免疫印迹）实验操作的常见问题原因与解决办法由普拉特泽生物旗下生物科研培训品牌《春风学院》对数千例WB检测实验分析后总结分享，分为上、中、下三个部分为大家详细讲解，文章末更有Western Blot实验理论+实操视频课程参考学习。普拉特泽生物提供线下WB检测培训及各类生物实验外包服务，是您生物科研路上的好盟友哦！

   好了废话不多说，上干货！

   常见问题 ：一、Western blot实验结果中背景较高

   原因1： 膜封闭不够，封闭不充分或封闭液不合适；

   解决方法：WB检测前选择更加合适的封闭液，并适当延长优化封闭条件时间与温度。

   原因2：一抗稀度不合适、孵育温度过高；

   解决方法：对抗体进行滴度测试，选择最合适的抗体稀释度，可以4℃结合过夜。

   原因3：抗体孵育浓度过高，孵育时间过长

   解决方法：优化或适当降低减少抗体孵育浓度与时间。

   原因4：洗涤不充分；

   解决方法：洗涤次数和时间适当延长。

   原因5：二抗非特异性结合；

   解决方法： 设置二抗对照，并选择合适的二抗试剂。

   原因6：膜在实验过程中干过（干膜）；

   解决方法：整个实验操作过程中保持膜湿润状态.

   原因7：蛋白质免疫印迹转膜过程中膜污染；

   解决方法：操作过程保持膜整洁，不要用手按压膜的任何部位，不要让膜接触带其他不干净的器材。

   原因8：发光底物过度残留；

   解决方法：吸干多余发光液后进行显影。

   原因9：显影时间过长；

   解决方法：压胶片的时间要长短适中，减少曝光时间，在显影液中不要停留太长或太短时间。

   常见问题 ：二、Western blot实验结果中无目的条带

   原因1：样本中所含目的蛋白表达量过低或无表达；

   解决方法：首先确认WB实验前期制备的蛋白样本可行性，对表达过低的样本进行富集后再进行实验；更换超敏ECL并适当延长曝光时间。

   原因2：Western Blot蛋白提取时降解；

   解决方法：蛋白提取时，保持低温状态，并加入相应的蛋白酶抑制剂。

   原因3：蛋白样本保存条件不合适，蛋白降解；

   解决方法：蛋白样本加入上样缓冲液煮沸变性后保存，对于稀有样本建议分装于-80℃保存，避免反复冻融，尽快完成检测。

   原因4：蛋白转膜效率低；

   解决方法：丽春红染色确认转膜体系是否正常。

   原因5：一抗二抗检测体系不匹配；

   解决方法：WB检测前选择合适的一抗二抗。

   原因6：抗体失活；

   解决方法：正确保存抗体。

   原因7：显影液使用时间过长；

   解决方法：使用新鲜试剂，并避光保存。

   好啦，Western blot实验常见问题原因以及解决方法上篇就先介绍到这里啦，欲知后事如何，且听下回分解！是不是很详细全面呢？想要详细学习实验操作方法的好学者们可点击《Western Blot实验理论+实操》观看学习哦！

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