Western Blot（蛋白质免疫印迹）实验操作注意事项由普拉特泽生物旗下生物科研培训品牌《春风学院》总结分享，根据成百上千例Western Blot检测经验汇总，从蛋白样本制备、凝胶配制、电泳、转膜、封闭、抗体杂交等方面详细讲解WB检测过程中常见容易忽略的操作错误与注意事项，新手必看。普拉特泽更提供线下WB检测培训及分子生物学实验各项外包服务。

   WB实验作为分子生物学中最为常见的实验，却蕴含了很多技巧与知识，看到别人WB检测结果那么漂亮，你连蛋白样本都制不出来是不是特别的羡慕嫉妒恨呢。不用担心，普拉特泽在和WB斗志斗勇的过程中积累了不少实验操作经验，为大家提供线上WB操作视频培训，线下实操一对一带教，是您提升实验操作技能的好老师哦。老话说，前人种树、后人乘凉，现在我们就来看看，WB实验过程中有哪些需要我们关注的操作注意事项吧！

   一、WB检测——蛋白样本制备注意事项

   1、蛋白质的样品制备是Western Blot的第一步，根据普拉特泽上万例蛋白质免疫印迹检测经验，WB待测组织净重与裂解液的体积比例为1g:10ML。同时，要想获得所有蛋白质，还应注意以下问题：

   （1）在合适的条件下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

   （2）选择合适的表面活性剂和还原剂，使其形成各自多肽的溶液。

   （3）尽量去除核酸、多糖、脂类等分子的干扰，裂解完毕离心之后取中层澄清溶液时避免吸到底层沉淀和上层脂类。

   （4）整个制作蛋白样本的制备过程必须在低温下进行，避免细胞破碎释放出各种酶类，但是注意不要反复冻融哦。

   二、WB检测——凝胶的配制注意事项

   制胶关键是聚合时间，分离胶聚合控制在从加入10%AP和TEMED至开始凝胶，时间为10—20分钟(未完全凝聚)，浓缩胶最佳聚合时间为8-10 min，可通过控制AP和TEMED量来控制。具体的实验操作方法与凝胶配方可以观看春风学院《western blot 理论+实操》参观学习哦。

   三、WB检测——电泳注意事项

   （1）应待凝胶充分凝固后电泳，或者催化剂加入后充分混匀，否则条带容易中间凹陷两边翘起。

   （2）两板玻璃之间排除所有的气泡，防止条带中间鼓两边下陷。

   （3）加样前离心，选择适当的样本缓冲液，加适量的样品促溶剂，防止wb条带拖尾或蛋白出现纹理。

   四、WB检测——转膜注意事项

   （1）要使Western Blot蛋白质组分能有效的从凝胶转移到固相纸膜上，缓冲液的PH值很重要。分子量不是很大的蛋白质区带要适当改变转移缓冲液的pH，而分子量较小的蛋白质，可以在缓冲液中加入适量甲醇促进它们固定在固相膜上（大分子量的蛋白质不适合加甲醇）。

   （2）电转印膜常用的NC膜使用的最为普谝，它的蛋白质容量大，可用各种染色方法进行检测，但是它与蛋白质的结合是非价性的，膜干燥后很脆。操作过程中要注意。

   五、WB检测——封闭注意事项

   （1）蛋白质免疫印迹电泳转膜过后，为防止与一抗或二抗非特异性结合，膜上其他没有结合蛋白质的空白位詈需要用封闭液加以封闭。

   （2）封闭液中加入适量的防腐剂，避免封闭蛋白变性影响封闭效果。

   六、Western Blot——抗体杂交注意事项

   （1）适当降低抗体的浓度，增加洗膜次数防止非特异性条带过多。

   （2）优化转移时间和电流，增加抗体的浓度，适当延长曝光时间，防止信号弱、可能转膜不完全。

   Western Blot实验操作每一步的注意事项小编就总结到这里啦，是不是对新手友好很全面避雷呢？想学习完整的WB（蛋白质免疫印迹）实验步骤的小伙伴可点此跳转学习哦：Western blot最全实验操作步骤。

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