CRISPR/Cas9技术是区别于ZFN与TALENs的最新基因编辑技术，并在近年迅速得到推广与应用。该技术拥有修饰效率高、操作简便、成本廉价等多个优点，因此在目前各项生物研究中成为最主流的基因编辑方式。
（一）技术起源与发展
CRISPR-Cas 系统最初是在细菌和古细菌的免疫系统中被发现的，它能够帮助这些微生物识别和抵御外源遗传物质的入侵，如噬菌体病毒和外源质粒等。

2012 年，科学家詹妮弗・杜德纳（Jennifer Doudna）和艾曼纽・夏彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）首次证明了 CRISPR-Cas9 系统在体外可以对 DNA 进行特异性切割。

2013 年，张峰等人将 CRISPR-Cas9 技术成功应用于哺乳动物细胞的基因编辑，开启了该技术在生物医学领域广泛应用的大门。

（二）系统组成与结构

Cas9 蛋白：是一种核酸内切酶，具有切割双链 DNA 的功能。它包含 RuvC1 和 HNH 样核酸酶结构域，这两个结构域分别负责切割 DNA 的两条链，从而产生双链断裂。Cas9 蛋白行使功能需要依赖向导 RNA 的引导以及靶序列相邻的原型间隔序列毗邻基序（PAM）的识别。

向导 RNA（gRNA）：由 CRISPR 转录产生的 crRNA 与反式激活的 tracrRNA 融合而成的单链引导 RNA（sgRNA）。sgRNA 的 5′端包含与靶 DNA 互补的 20nt 左右的序列，用于定位需编辑的位点；3′端则是与 Cas9 蛋白结合的区域，通过与 Cas9 蛋白相互作用，引导其到达目标基因的特定 DNA 序列上。
（三）作用机

识别与结合：sgRNA 首先与 Cas9 蛋白形成复合物，然后通过其 5′端的互补序列在基因组中寻找与之匹配的靶 DNA 序列。当找到匹配的靶序列后，sgRNA-Cas9 复合物会与靶 DNA 结合，同时识别靶序列下游的 PAM 序列，PAM 序列一般为 5′-NGG，它作为一种识别信号，确保 Cas9 蛋白能够准确地结合到目标 DNA 上。

切割作用：在结合到靶 DNA 后，Cas9 蛋白的核酸酶结构域会被激活，分别在 PAM 序列上游第 3 个碱基处对 DNA 的两条链进行切割，产生双链断裂。这种双链断裂是细胞内 DNA 修复机制启动的信号，细胞会通过非同源末端连接或同源重组修复机制来修复断裂的 DNA。

修复与编辑：非同源末端连接是一种易错的修复方式，在修复过程中常常会引入插入或缺失突变，导致基因阅读框发生改变，从而使基因功能丧失，实现基因敲除的效果。而如果在细胞中同时提供含有目的基因片段的供体 DNA 模板，细胞则会通过同源重组修复机制，以供体 DNA 为模板，将目的基因片段精准地插入到靶位点，实现基因敲入或替换等精确编辑。
（四）CRISPR/Cas9的优势

①高效性：能够在多种细胞类型和物种中实现高效的基因编辑，大大提高了基因编辑的成功率和效率，为大规模的基因功能研究和基因治疗等应用提供了有力支持。

②简便性：与传统的基因编辑技术相比，CRISPR-Cas9 系统的构建和操作相对简单。只需要设计和合成针对目标基因的 sgRNA，并将其与 Cas9 蛋白表达载体共同导入细胞中，即可实现基因编辑，无需复杂的蛋白质工程和基因克隆等操作，降低了实验难度和成本。

③特异性：通过合理设计 sgRNA，可以实现对基因组中特定目标基因的精确编辑，具有较高的靶向特异性。同时，随着技术的不断发展和优化，对脱靶效应的控制也越来越有效，进一步提高了编辑的准确性和可靠性。

④多重编辑能力：可以同时设计多个针对不同靶位点的 sgRNA，实现对多个基因或同一基因的多个位点进行同时编辑，能够更全面地研究基因之间的相互作用和复杂的生物学过程。

（五）CRISPR/Cas9的局限性

①脱靶效应：尽管经过不断优化，CRISPR-Cas9 系统仍然存在一定程度的脱靶风险，即可能会在非目标位点产生切割和编辑，导致意想不到的基因突变，从而影响实验结果的准确性和可靠性，甚至可能产生潜在的安全隐患。    

②编辑效率问题：在某些细胞类型或特定的基因组区域，CRISPR-Cas9 的编辑效率可能不够理想，无法达到预期的编辑效果，需要进一步优化实验条件或采用其他辅助手段来提高编辑效率。           

③PAM 序列限制：Cas9 蛋白识别的 PAM 序列相对有限，这在一定程度上限制了可编辑的靶点范围。对于一些缺乏合适 PAM 序列的基因区域，可能无法直接使用常规的 CRISPR-Cas9 系统进行编辑，需要开发具有不同 PAM 特异性的 Cas9 变体或其他基因编辑工具来解决。 

④伦理和法律问题：随着 CRISPR-Cas9 技术在人类基因编辑等领域的应用逐渐深入，引发了一系列伦理和法律方面的争议和担忧，如生殖细胞基因编辑可能带来的遗传改变和伦理风险等，我们需要在技术发展的过程中建立健全相应的伦理准则和法律法规来规范其应用。