【知识讲解】Cripsr-Cas9基因编辑技术的应用

（一）基因敲除（Knock - out）策略

原理：

CRISPR - Cas9 系统中的 Cas9 蛋白是一种核酸内切酶，它在向导 RNA（gRNA）的引导下，能够识别并结合到目标基因的特定 DNA 序列上。Cas9 蛋白会在目标 DNA 序列上产生双链断裂（DSB）。细胞自身的修复机制会对 DSB 进行修复，在非同源末端连接（NHEJ）修复过程中，常常会引入插入或缺失（indels）突变。这些突变可能会导致基因阅读框发生改变，产生移码突变，从而使基因功能丧失。

应用场景

①用于研究基因功能：以在研究肿瘤相关基因为例，可以通过 CRISPR - Cas9 敲除某个疑似致癌基因，观察细胞表型变化，如细胞增殖、凋亡、迁移等能力的改变，从而确定该基因在肿瘤发生发展中的作用。

②构建疾病模型：以神经退行性疾病为例，可以在动物模型（如小鼠）中敲除与疾病相关的基因，如阿尔茨海默病相关的 APP 基因，模拟疾病的发生过程，为研究疾病的发病机制和药物研发提供基础

示例

我们想要敲除小鼠胚胎干细胞中的 Oct4 基因，该基因对维持干细胞的多能性很重要。因此我们可以设计针对 Oct4 基因的 gRNA，将其与 Cas9 蛋白一起导入小鼠胚胎干细胞。Cas9 在 gRNA 引导下在 Oct4 基因的特定位置切割 DNA，细胞通过 NHEJ 修复产生突变，最终导致 Oct4 基因功能丧失，干细胞失去多能性。
（二）基因敲入（Knock - in）策略
原理

基于 CRISPR - Cas9 产生的双链断裂，利用细胞的同源重组（HR）修复机制来实现基因敲入。在提供含有目的基因片段的供体 DNA 模板的情况下，细胞可以以该模板为参照，将目的基因整合到基因组的目标位置。这个供体 DNA 模板两侧需要有与目标基因组切割位点两侧同源的序列，以引导同源重组的发生。
应用场景
    ①基因治疗：对于一些单基因遗传病，如镰状细胞贫血，其病因是 β - 珠蛋白基因发生突变。可以利用 CRISPR - Cas9 将正常的 β - 珠蛋白基因敲入患者自身造血干细胞的基因组中，使这些干细胞能够产生正常的血红蛋白，从而治疗疾病。
    ②构建基因表达模型：可以将带有特定标签（如荧光蛋白基因）的序列敲入目标基因的特定位置，通过观察荧光信号来研究目标基因的表达模式和定位
示例
    在果蝇研究中，为了研究特定基因在神经元中的表达情况，将绿色荧光蛋白（GFP）基因敲入目标基因的起始密码子附近。通过 CRISPR - Cas9 系统在目标基因位置产生双链断裂，同时提供含有 GFP 基因以及与目标基因切割位点两侧同源序列的供体 DNA。在 HR 修复过程中，GFP 基因整合到目标基因位点，使果蝇神经元中表达的目标基因带有 GFP 标签，方便观察神经元中该基因的表达和分布。
  （三）基因激活（Activation）或抑制（Repression）策略

原理

激活策略：通过改造 Cas9 蛋白形成激活型 Cas9（dCas9 - activator），dCas9 蛋白失去了核酸内切酶活性，但可以在 gRNA 引导下结合到目标基因的启动子区域。同时，dCas9 - activator 融合转录激活因子，如 VP64 等，这些激活因子可以招募 RNA 聚合酶等转录机器，从而促进目标基因的转录激活。

抑制策略：构建抑制型 Cas9（dCas9 - repressor），它可以结合到目标基因的启动子或编码区域，通过干扰转录因子结合或阻碍 RNA 聚合酶的移动等方式来抑制基因的转录。
应用场景

①研究基因调控网络：在细胞分化过程中，许多基因的表达受到严格调控。通过激活或抑制某些关键基因，可以研究它们对下游基因表达和细胞分化方向的影响。

②药物靶点筛选：对于一些疾病相关基因，可以通过激活或抑制这些基因来观察细胞表型变化，筛选可能的药物靶点。
示例

在干细胞分化研究中促进干细胞向心肌细胞分化，利用 dCas9 - activator 靶向心肌细胞特异性基因（如 Myh6）的启动子区域，激活该基因的表达。且结合其他信号通路的调节，引导干细胞向心肌细胞方向分化，为心肌细胞再生医学研究提供策略。

ok，本篇文章就到这里，现在了解一些关于基因编辑技术的应用了吗？