【知识讲解】细胞转染与实验常见问题解决方法

细胞转染是一种将外源核酸（如DNA或RNA）导入细胞的技术，广泛应用于生物医学研究和药物开发。在生物医学研究中，细胞转染是一项核心技术，它使得我们能够将外源基因引入细胞内，研究基因功能和信号通路。

今天，我们就来聊聊细胞转染的那些事儿！

一.细胞转染分类
1根据转染方式分类可以分为：

化学转染：主要有脂质体介导的转染（Lipofection）、阳离子聚合物转染（如聚乙烯亚胺PEI）、磷酸钙共沉淀法等。

物理转染：主要包括电穿孔（Electroporation）、显微注射（Microinjection）、基因枪（Gene Gun）、超声转染（Sonoporation）等。

生物转染：主要是病毒介导的转染，使用改造后的病毒（如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒AAV）将外源基因导入细胞，适用于长期和稳定的基因表达。

核糖核酸（RNA）转染：包括mRNA转染、siRNA/miRNA转染等。

此外，还有基因编辑技术比如CRISPR/Cas9系统：利用CRISPR/Cas9技术进行精确的基因编辑，可以实现基因的敲除、插入或替换。其他转染方法细胞穿透肽（Cell-Penetrating Peptides, CPPs）、磁珠介导的转染。

选择合适的转染方法时，需要考虑细胞类型、实验目的、核酸的性质、实验条件以及对细胞毒性的要求。不同的转染方法有其特定的优势和局限性，因此在实际操作中可能需要根据实验需求进行优化和调整。

2.根据转染是否把外源核酸整合到宿主染色体分为：

瞬时转染：将外源性核酸引入细胞，使其在短时间内表达目标基因，不整合在细胞的染色体上。核酸在细胞内仅存在较短时间，适合于需要快速获取数据的实验，能够迅速检测基因功能或表达。

稳定转染：将外源性核酸引入细胞，使其整合到细胞染色体中，实现长期表达。通过筛选和扩增，虽然建立过程较长，但提供了稳定的表达系统，适用于生产和长期研究。

二.细胞转染实验常见的问题及解决方案
1.转染效率低
可能是由于细胞状态差或细胞密度不适宜。应选择生长状态良好的细胞，并按照转染试剂要求的密度接种细胞。

转染条件需要优化，比如调整阳离子脂质体试剂和DNA的量。

如果在存在血清的条件下形成DNA-阳离子脂质体试剂复合物，可能会降低转染效率。建议在复合物形成时不要使用血清。

    检查转染体系中是否存在抑制剂，如抗生素、EDTA、柠檬酸盐等，这些可能会影响转染效率。
    2.细胞死亡率高：
    DNA量太高或阳离子脂质体试剂量太高都可能导致细胞死亡率增加。建议进行剂量-反应曲线实验以确定最佳用量。

    避免在转染过程中使用抗生素，因为阳离子脂质体试剂可能使细胞对抗生素更敏感。
    2.转染重复性不好：
    保持所有转染参数恒定，如融合度、传代次数和生长时间，以减少批次间的波动。
    如果细胞在培养过程中发生变化，可能影响转染的重复性。建议使用来源于经选择转染效率较高的亚系细胞，或使用新融化的细胞进行实验。
    3.电转后细胞死亡率高：

优化电转参数，如电压、脉冲时间和脉冲次数，针对目标细胞确定最佳的电转参数。
使用合适的电转缓冲液，确保能够有效导电，同时减少细胞损伤。

    4.转染了抗性基因的细胞加药筛选后，细胞死亡：
    确保加药时间适宜，一般建议转染后48小时再加药，以确保细胞有足够的时间表达抗性基因。调整加药浓度，确保不超过抗性基因能够应对的范围。
    5.配制转染复合物时是否一定要用无血清培养基：
    通常建议使用无血清的培养基或转染试剂自带的组分，因为血清中的蛋白质可能干扰阳离子脂质体/聚合物对核酸的吸附。
    6.转染效率的验证：
    使用qPCR进行验证是最准确的。也可以通过荧光观察，尤其是使用病毒转染时，可以添加荧光标记帮助观察转染效率。
    通过以上措施，可以提高细胞转染的效率和成功率，减少实验中的变量和潜在问题。