Western blot（蛋白质免疫印迹）实验操作常见问题原因及由普拉特泽生物旗下生物科研培训品牌《春风学院》总结分享，普拉特泽生物提供线下WB实验外包与实验理论实操的线上下培训，实验真、周期短、人才广、技术高！

   上篇咱们分享了Western blot实验结果中背景较高、无目的条带两个常见问题都还记得吗？不记得可点击《Western blot检测实验常见问题原因以及解决方法（上）》回去复习哦~那这篇们继续总结学习吧~

   常见问题一、Western blot实验结果中杂带较多

   原因1： 目的蛋白有多个修饰位点，如磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等，本身可以呈现多条带；

   解决方法：WB实验前查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

   原因2：实验检测的目的蛋白有其它剪切本；

   解决方法：查阅文献或生物信息学分析可能性。

   原因3：样本处理过程中目的蛋白发生降解；

   解决方法：WB检测的蛋白样本加入蛋白酶抑制剂同时样本处理时在冰上操作。

   原因4：上样量过高，太敏感；

   解决方法：尽量减少上样量，注意观察。

   原因5：一抗不纯或特异性不高；

   解决方法：纯化抗体，或者重新选择或制备高特异性的抗体。

   原因6：一抗或者二抗浓度偏高；

   解决方法：降低一抗、二抗浓度。

   常见问题二、Western blot实验结果中条带大小与理论值位置不符

   原因1：Marker指示大小偏差；

   解决方法：WB实验中选择合适的预染Marker，并与非预染Marker 对比，观察差异大小。

   原因2：琼脂糖凝胶电泳体系影响；

   解决方法：避免边缘孔的不稳定因素，在中间孔上样，边缘孔加入等量上样缓冲液平衡体系。

   原因3：翻译后修饰；

   解决方法：查阅文献，确认蛋白本身是否存在磷酸化或糖基化等修饰。

   原因4：翻译后剪切及异构体；

   解决方法：查阅文献，确认蛋白是否存在多种剪切活性形式。

   原因5：蛋白多聚体形成；

   解决方法：蛋白二聚体或多聚体形成，在样本制备过程中，使用新鲜的DTT或β-巯基乙醇，保持蛋白单体状态。

   原因6：蛋白相对电荷变化；

   解决方法：蛋白氨基酸组成不同，某些蛋白所带电荷未能被带负电的SDS所覆盖，导致蛋白迁移率与蛋白大小不成正比。

   OK，Western blot实验常见问题原因以及解决方法中篇就我们就总结完咯，秃头小宝贝们学会了吗？希望能帮到在实验室埋头苦干的实验人员，想要详细学习实验操作方法的好学者们可点击《Western Blot实验理论+实操》观看学习哦！

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